Расшифрована структура комплекса I дыхательной цепи митохондрий быка

Рис. 1. Устройство дыхательной цепи переноса электронов. Схематично изображены все четыре комплекса этой цепи. Они располагаются на внутренней мембране митохондрии и обеспечивают протекание нескольких реакций, в результате которых на мембране создается протонный градиент, который в свою очередь использует АТФ-синтаза(ATP Synthase) для синтеза АТФ. Подробное описание работы цепи приводится ниже в тексте новости. Изображение с сайта ru.wikipedia.org

 

Группа ученых из Великобритании и Китая методом крио-электронной микроскопии расшифровала структуру комплекса I (NADH-дегидрогеназный комплекс) электрон-транспортной цепи митохондрий быка Bos taurus. Работа, опубликованная в журнале Nature, развивает результаты той же группы, полученные в 2014 году, когда ученым удалось в общих чертах разобраться, как устроена структура этого комплекса. Теперь они получили новые данные о функционировании и сборке NADH-дегидрогеназы, с помощью которых уже можно судить о роли мутаций в развитии связанных с ней наследственных заболеваний.

 

 

На клеточном уровне дыхание — это сложная последовательность окислительно-восстановительных реакций, в результате которой клетка запасает энергию в виде молекул АТФ (их еще называют универсальной энергетической валютой клеток). Этот процесс обеспечиваетсядыхательной цепью переноса электронов — системой из нескольких белковых комплексов, которые располагаются в клеточной мембране (схематично они изображены на рис. 1; также работа цепи показана на этой анимации).

Первый в этой цепи — NADH-дегидрогеназный комплекс (его так и называют — комплекс I). У эукариот он функционирует в митохондриях, но также встречается и у способных к дыханию прокариот. Этот комплекс осуществляет реакцию окисления NADH, при этом происходит перенос четырех протонов из матрикса митохондрии или цитоплазмы прокариот наружу:

NADH+H++Q+4H+in→NAD++QH2+4H+out.NADH+H++Q+4Hin+→NAD++QH2+4Hout+.

В ходе этой окислительно-восстановительной реакции, катализируемой NADH-дегидрогеназным комплексом, NADH окисляется до NAD+, что сопряжено с восстановлением убихинона (Q) до убихинола (QH2). Энергия реакции используется для транспорта протонов из матрикса митохондрий (H+in) наружу (H+out) — и именно шаг транспорта протонов вызывает у ученых больше всего вопросов.

Дальнейшая работа дыхательной цепи устроена так. Восстановленный до убихинола убихинон транспортируется к следующему участку —цитохром-bc1-комплексу, где окисляется и передает свои электроны цитохрому с. Восстановленный цитохром с, в свою очередь, окисляется очередным участком цепи — цитохром с-оксидазой. В случае кислородного дыхания, этот последний комплекс завершает путешествие электронов по дыхательной цепи, восстанавливая ими кислород до воды.

Целью всей этой эстафеты по передаче электронов от NADH кислороду является аккуратное расходование энергии, запасенной в реакции их прямого взаимодействия. На каждом ферментативном комплексе дыхательной цепи энергия, выделяющаяся в ходе окислительно-восстановительных реакций (передача электронов), идет на транспорт протонов из матрикса митохондрий (цитоплазмы прокариот) наружу. Этот процесс помогает формировать трансмембранный протонный потенциал, который используется АТФ-синтазой для синтеза АТФ. На долю NADH-дегидрогеназного комплекса приходится порядка 40% работы по созданию трансмембранного потенциала.

В последние несколько лет разными группами ученых уже были изучены структуры комплекса I из бактерии Thermus thermophilus, дрожжевого гриба Yarrowia lipolytica и быка (рис. 2). Исследования бычьего варианта комплекса I важно, поскольку он близок к гомологичному ферменту человека. Но в 2014 году ученым (авторам и обсуждаемой работы) не удалось полностью расшифровать структуру — были получены данные только для 28 субъединиц из 45.

Рис. 2. А — структура комплекса I дыхательной цепи быка Bos taurus по данным из обсуждаемой статьи. Синим цветом выделены субъединицы, образующие консервативное ядро, красным — специфические для млекопитающих дополнительные субъединицы. Комплекс состоит из 45 субъединиц, его масса — 1000 кДа. В N-модуле комплекса происходит связывание и окисление NADH, в Q-модуле восстанавливается убихинон. Два этих отдела соединены цепочкой Fe—S-кластеров (желто-оранжевые блоки, схема их расположения вынесена во врезку). Схематично указано расположение комплекса относительно внутренней мембраны митохондрии. Б — структура комплекса I бактерии Thermus thermophilus (16 субъединиц, масса — 536 кДа) из статьи R. Baradaran et al., 2013. Crystal structure of the entire respiratory complex I. Разными цветамивыделены разные субъединицы. Pp- и Pd-модули образуют протонную помпу, которая переносит протоны в межмембранное пространство, принимая участие в формировании протонного градиента, необходимого для синтеза АТФ при окислительном фосфорилировании. В — структура комплекса I дрожжевого гриба Yarrowia lipolytica(48 субъединиц, масса — 1000 кДа) из статьи V. Zickermann et al., 2015. Mechanistic insight from the crystal structure of mitochondrial complex I, как и на рисунке Б, здесь разными цветами выделены и подписаны разные субъединицы. Г — неполная структура NADH-дегидрогеназы по данным исследования K. R. Vinothkumar et al., 2014. Architecture of mammalian respiratory complex I. Fe—S-кластеры показаны красными точками

 

Такой интерес к NADH-дегидрогеназному комплексу вызван загадками в механизме его функционирования, а также клинической значимостью ассоциированных с ним заболеваний. С нарушениями в функционировании первого дыхательного комплекса связаны некоторые митохондриальные заболевания: например, синдром Лея и оптическая нейропатия Лебера. Кроме того, по последним исследованиям, существует связь между дефектами NADH-дегидрогеназы и развитием болезни Паркинсона. Поэтому детальное изучение фермента может позволить глубже разобраться в причинах заболеваний и подсказать пути к их лечению.

Сейчас ученые получили полную структуру комплекса I — удалось расшифровать все 45 субъединиц, входящих в его состав. Теперь понятно, что 14 субъединиц образуют консервативное ядро, сохраняющееся в структурах гомологичного фермента бактерий и грибов, а 31 субъединица специфична для млекопитающих. Комплекс имеет характерную L-образную форму — вертикально расположенная часть комплекса содержит сайты связывания NADH и убихинона и выдается в матрикс митохондрии. Горизонтальная часть заякорена во внутренней мембране митохондрии и является протонной помпой — именно она переносит протоны из матрикса в межмембранное пространство. Сайт связывания NADH расположен в дистальном отделе матриксной части комплекса. Ближе к мембранной части локализуется сайт связывания убихинона.

Два этих сайта соединены цепочкой из специальных кофакторов — железосерных кластеров (рис. 3), способных менять степень окисления. По этой цепочке происходит передача электронов между NADH и убихиноном. Предполагается, что перераспределение отрицательных зарядов, возникающее при восстановлении убихинона, вызывает небольшие изменения в структуре комплекса (конформационные перестройки), которые передаются в его мембранную часть. Это, по всей видимости, приводит к поляризации местных заряженных аминокислотных остатков, которые формируют для протонов трансмембранные каналы, что и обеспечивает перенос частиц. Косвенные данные в пользу гипотезы присутствуют в описываемой работе — исследователям удалось получить несколько «подструктур», которые можно трактовать как активное и неактивное состояния комплекса. Это стало возможным благодаря используемому ими методу крио-электронной микроскопии (см. Cryo-electron microscopy).

Суть метода заключается в том, чтобы сфотографировать в электронный микроскоп интересующую нас молекулу с разных ракурсов, а потом реконструировать ее пространственную структуру. Но одной молекулы для такой операции недостаточно. Вместо этого на специальную ячеистую подложку наносят раствор молекул, а затем мгновенно замораживают его в жидком этане. Получается, что часть частиц застыла «в профиль», часть — «в анфас», а некоторые — «в 3/4». Фотографируя подложку в электронном микроскопе, мы получаем многие десятки или даже сотни тысяч изображений молекулы с разных сторон. Последующая компьютерная классификация изображений («в профиль» отдельно, «в анфас» отдельно) и их выравнивание позволяет значительно снизить уровень шума и достичь атомарного разрешения, после чего проводится сборка пространственной структуры молекулы.

На момент замораживания интересующая нас молекула может находиться в разных конформационных состояниях (если это фермент, то на разных стадиях каталитического цикла, например) и все они будут мгновенно зафиксированы. При автоматическом анализе изображений возможно отличать такие состояния и реконструировать не одну конформацию, как в случае рентгеноструктурного анализа, а несколько, что может пролить свет на детали функционирования комплекса.

Как заключают авторы статьи, именно этот подход (изучение конформационных изменений посредством крио-электронной микроскопии) является наиболее перспективным для дальнейшего изучения комплекса I дыхательной цепи и проверки существующих гипотез о роли промежуточных продуктов восстановления убихинона в механизме функционирования фермента.

Источник: Jiapeng Zhu, Kutti R. Vinothkumar & Judy Hirst. Structure of mammalian respiratory complex I // Nature. 2016. V. 536. P. 80–84.

Материалы с сайта http://elementy.ru/novosti_nauki/432820/Rasshifrovana_struktura_kompleksa_I_dykhatelnoy_tsepi_mitokhondriy_byka

Дмитрий Сутормин